目的：研究肠道菌群失调对溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC)的影响。方法：通过使用3.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)溶液诱导建立小鼠溃疡性结肠炎模型，同时观察小鼠的体重变化，便血情况，再进行结肠组织病理学检测，观察结肠组织病理变化，然后采用基于16SrRNA基因测序技术进行正常小鼠与溃疡性结肠炎小鼠的肠道菌群测定，利用数据信息分析得到的热图（Heatmap）分析肠道菌群的变化。结果：溃疡性结肠炎小鼠模型体重下降，出现便血，且肠道粘膜受损，隐窝结构破坏，同时正常小鼠与溃疡性结肠炎小鼠中的肠道菌群含量存在着显著差异，溃疡性结肠炎小鼠肠道中的致病菌脱硫弧菌和副拟杆菌属相对丰度明显高于正常小鼠。结论：肠道菌群与溃疡性结肠炎密切相关，肠道菌群的失调在溃疡性结肠炎的发生中发挥着重要的作用。

　　溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis,UC)作为炎症性肠病（IBD）的一种亚型，是一种非特异性慢性炎症性肠病，其病变主要累及结肠粘膜和黏膜下层，多从远段的结肠开始，可以逆行向近段发展，临床主要表现为腹泻、腹痛及血便[1]。其发病机制还不明确，可能与免疫、细菌、遗传、病毒、营养以及其他环境因素有关[2]。许多的研究已经表明，肠道内的菌群与UC密切相关，在UC患者或动物模型中大多都存在肠道内菌群失调的现象。

　　人体的肠道内存在着大量的微生物，包含着有益菌和致病菌。在正常情况下，肠道内的菌群处于动态平衡的状态。有研究认为肠道菌群失调可能参与UC的始动或持续，可能是UC的触发点，当肠道内致病菌增加时，会影响肠上皮细胞的代谢，使得肠道粘膜通透性增加，并促使肠粘膜的免疫功能失调，从而诱发了肠道炎症[3]。因此，肠道菌群的失调，是UC发病的一个重要因素。

　　在对肠道菌群的研究当中，传统的分离培养法只能检测出肠道中的部分菌群，耗时费力，并且对培养条件要求较高等缺点。近年来，随着分子生物学技术的发展，分子生物学检测方法在肠道菌群测定中具有更大的优势。基于

　　16SrRNA基因测序技术具有快速、高效、特异性高等特点，可用于微生物鉴定，主要用于菌群构成和物种多样性等分析，比传统的鉴定方法有更大的优势，覆盖范围更加广泛几乎可测定所有的物种，甚至痕量的微生物，其微生物含量分析准确[4]。

　　清洁级雄性ICR小鼠购买于湖南斯莱克锦达公司，体重20±2g。饲养在湖南中医药大学动物中心，给予标准饲料，自由饮用无菌水，环境温度20℃，相对湿度36%。

　　清洁级雄性ICR小鼠12只，适应性喂养一周后，随机分为空白组、模型组，每组6只。模型组小鼠以3.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液作为饮用水，持续造模8天，空白组6只小鼠饮用纯净水。在使用DSS建模过程中，小鼠均出现了体重下降、稀便、便血及肛周污秽等，结肠组织病理学检测中显示肠道上皮结构破坏、腺体排列异常、炎症细胞浸润等，则表明建模成功，可用于下一步的研究[5]。

　　把小鼠处死后，解剖，切取结肠部分，制成的组织体积不超过1mm×1mm×1mm大小，再进行固定、脱水、渗透、包埋、切片、染色处理过程，并在光学显微镜下观察，采集图像分析。（该过程送至武汉赛维尔生物科技有限公司

　　统计数据使用GraphPadPrism8.3.0进行数据处理及分析，两组比较采用Multiplettests。0.01P0.05表示显著性差异，通常以*标记；P0.01表示极显著性差异，通常以**标记。

　　模型组小鼠在建模的第4天开始出现肉眼血便，在第6天出现明显的体重下降，在建模的第8天模型组小鼠体重与空白组小鼠体重对比下降非常明显，有极显著差异（P0.01）。见图1。

　　由结果表明，空白组小鼠的肠道粘膜完整、连续，腺体排列整齐，隐窝结构正常。模型组小鼠的肠道粘膜受损，隐窝结构破坏，有大量炎症细胞浸润。见图2。

　　将小鼠处死，在超净工作台上取小鼠肠道内容物，在-80℃冷冻保存，并送至百迈克公司进行肠道菌群的测定。

　　3.1.2建库测序提取样品总DNA后，根据全长引物序列合成带有Barcode的特异引物，进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库（SMRTBell），建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用PacBioSequel进行测序。

　　数据预处理：将PacBio下机数据导出为CCS文件(CCS序列使用Pacbio提供的smrtlink工具获取)后，主要有如下3个步骤：

　　(2)CCS过滤：使用cutadapt1.9.1软件进行引物序列的识别与去除并且进行长度过滤，得到不包含引物序列的

　　(3)去除嵌合体：使用UCHIMEv4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到Effective-CCS序列。信息分析内容：划分Feature(OTUs、ASVs)、多样性分析、差异分析、相关性分析及功能预测分析（具体见分析结果）。

　　通过统计数据处理各阶段样品序列数目，评估数据质量。主要通过统计各阶段的序列数，序列长度等参数对数据进行评估。

　　各样品测序数据评估结果如下表所示：SampleID为样品名称；Raw-CCS为该样本识别CCS数；CleanCCS为引物去除和长度过滤后的序列数；Effective-CCS为用于去除嵌合体后用于后续分析的序列数；AvgLen(bp)为样品平均序列长度；Effective(%)为Effective-CCS占Raw-CCS的百分比。

　　在PacBio测序平台，基于微生物的16SrRNA基因，利用单分子实时测序（SMRTCell）的方法对marker基因进行测序,得到了关于空白组与模型组小鼠肠道菌群热图（Heatmap）见图3。Heatmap是以颜色梯度来代表数据矩阵中数值的大小并根据物种或样品丰度相似性进行聚类的一种图形展示方式。热图对应的值为每一行物种的相对丰度经过标准化处理后得到的Z值，颜色梯度由蓝色到红色表示相对丰度由低到高。通过对小鼠肠道20中菌群测定，得到的热图可以看出，空白组与模型组小鼠中的肠道菌群含量存在着显著差异，这表明在UC中，肠道菌群的结构和含量发生了改变，可能存在肠道菌群的失调。再对两组中的致病菌脱硫弧菌（Desulfovibrio），副拟杆状菌属

　　（Parabacteroides）进行对比分析，模型组中的脱硫弧菌和副拟杆菌属丰度明显高于空白组，表明肠道菌群的种类与UC的发生有着很大的关系。

　　人体内存在着众多的微生物，肠道菌群和人体相互作用形成动态平衡，起到维持机体内环境稳态的作用。肠道菌群主要为厚壁菌门和拟杆菌门，根据需氧情况，可分为专性厌氧菌、兼性厌氧菌和好氧菌，其中双歧杆菌、乳酸杆菌等为对人体有益的细菌，也是人体的优势菌群，而肠球菌、副拟杆状菌属、脱硫病毒菌种等为对人体有害的细菌。人体肠道内的有益菌和致病菌通过相互竞争来维持肠道内的平衡，当肠道菌群失调时，有益菌数量减少，致病菌会大量增加，肠粘膜屏障受损，打破了肠道黏膜免疫系统的平衡，从而诱发了肠道炎症[6]。UC的发病与肠道微生

　　物群密切相关，肠道菌群失调还会加重疾病程度，许多研究都表明UC患者肠道微生物群的组成和功能受到了破坏

　　在溃疡性结肠炎中，脱硫病毒菌种增加，这些细菌在急性溃疡性结肠炎的结肠微生物群中所占百分比增加[8]。同时有研究数据证明了结肠炎小鼠肠道内的双歧杆菌、乳酸杆菌等减少，而副拟杆状菌属、肠球菌等比例增加[9]。

　　由上文的热图分析可知，肠道菌群的结构和含量发生了明显的变化，结肠炎小鼠肠道内的致病菌副拟杆状菌属和脱硫病毒菌种含量明显增加，存在肠道菌群失调现象，肠道菌群中的致病菌对于结肠炎的诱发起着不可忽视的作用，这与上述的研究结果一致。

　　16SrRNA序列分析技术利用细菌16SrRNA序列，进行测序分析，可用于对细菌进行快速种属鉴定，解决了传统分离与鉴定方法耗时、耗力、效率低、研究范围小等问题，现已经被广泛应用于微生物鉴定[10]。16SrRNA为核糖体

　　RNA的一个亚基，其基因长度适宜，大小约1500左右，基因拷贝数多，信息量大且易分析，存在于所有的原核微生物中，可作为原核生物分子标志物，由于16SrRNA基因具有典型的保守区和高变区，保守片段被用来衡量不同物种的近缘程度，高变异片段则反应物种之间的差异[11]。使用16SrRNA基因测序技术进行肠道菌群的测定，测定结果更加直观、准确。

　　综上所述，本文通过构建溃疡性结肠炎小鼠模型，利用16SrRNA基因测序技术，测定了空白组与模型组小鼠的肠道菌群，通过热图的对比分析，发现了结肠炎小鼠的肠道菌群结构和含量较正常小鼠发生了显著的变化，并且致病菌含量明显增加，存在肠道菌群失调现象，也表明了肠道菌群与UC密切相关。由于本文的只测定了肠道中的部分菌群，同时肠道中有益菌种的测定较少，还需要更多的数据来进一步证实。

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　　本论文采用超声法提取车前草总黄酮进行研究，以紫外分光光度法为含量测定方法，以芦丁得率为指标，并以超声功率、溶剂量、提取时间、提取次数作为考察因素。然后通过单因素进行对比，进一步得到每一个因素与总黄酮提取率之间的关系，再进行正交实验，得到车前草中总黄酮的最优效提取条件，为280W的超声功率、料液比为1：

　　20，提取温度为50℃，提取时间为30分钟时，此条件下车前草中总黄酮的提取率最高为2.57%。

　　车前草为车前科植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥或新鲜全草。具有清热，抗菌，利尿，祛痰，凉血，解毒，抗氧化的功能，用于水肿尿少，热淋涩痛，暑湿泻痢，痰热咳嗽等，对于治疗流行性腮腺炎、尿潴留、慢性活动性肝炎等疾病具有一定成效[1]。全国大部分地区均产。不仅可食用，还可药用。车前草，最早见于我国古代第一部诗歌总集《诗经》的一首诗——《国风·周南·芣苢》：“采采芣苢，薄言采之。采采芣苢，薄言有之”“芣苢”即车前草[2]。车前初以种子入药，始载于《神农本草经》，《名医别录》并用叶及根。《本草经集注》云：“人家路边甚多。”《本草图经》云：“……今江湖、淮甸、近京、北地处处有之。春初生苗，叶布地如匙面，累年者长及尺余，如鼠尾，花甚细，青色微赤；结实如葶苈，赤黑色。”并绘“滁州车前子”图。据形态确为车前科植物车前。现代研究表明，车前草中含有多种化学成分：黄酮及其苷类、多糖类、环烯醚萜及其苷类、三萜及其甾体类、挥发油、微量元素等[3]。黄酮类化合物是车前草中的主要有效成分，具有很广泛的生物活性，如抗菌消炎、抗氧化，降血糖调血脂等[4]。随着分离纯化技术的提高，目前国内外学者从车前草中分离出的黄酮类成分主要有木犀草素、高车前苷(Homoplantagin,Plantagoside)，车前苷(Plantagin)为黄芩素-7葡萄糖等[5]，而且这类成分具有较强的生物活性，在临床治疗中有着较高的价值。因此，车前草中总黄酮成分的提取优化工艺研究对于药效物质基础研究及车前草新产品的开发都具有重要意义[6]。

　　车前草中的黄酮类化合物车前子苷对DP-PH自由基和ABTS+自由基有极强的清除作用，并可以抑制脂质体过氧化，苯乙醇苷类化合物也有很强的抗氧化活性；车前草多糖在体外有较强的自由基清除能力；车前草中的水溶性膳食纤维对OH-自由基也存在着很强的清除作用，对O2-也有较高的清除作用[7]。

　　用车前子提取液给小鼠灌胃，能明显延长小鼠游泳时间、常压缺氧存活时间及亚硝酸钠中毒性组织缺氧存活时间，能明显增加SOD的活性，减少过氧化脂质LPO的生成，延缓衰老[12]。利用邻苯三酚自氧化体系产生超氧阴离子自由基(O2)及邻二氮菲Fe2+/H2O2体系产生羟自由基(OH)，采用分光光度法研究鲜车前草和干车前草水煎液对氧自由基的清除作用。鲜车前草及干车前草水煎液对O2和OH均有显著的清除作用(P0.01)。鲜车前草和干车前草水煎液对氧自由基清除作用无显著差异(P0.05)[13]。车前草抗氧自由基的药理作用可能是其抗衰老的机制。

　　车前草的不同有机溶液（无水乙醇、甲醇、、石油醚、三氯甲烷和苯）提取物均具有一定的抗菌作用，对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、青霉和假丝酵母等常见的食物致病菌有明显的抑制作用，对铜绿假单细胞的抑制作用也较好。另外对常见的植物病原菌苹果腐烂病菌、黄瓜枯萎病菌、烟草赤星、草莓镰刀菌、番茄灰霉等也有显著的抑制作用[8]。

　　对泌尿系统的影响：可促进水、氯化钠、尿素与尿酸的排泄。用于各种水肿。车前草乙醇提取物可抑制马肾脏

　　Na+，K+-ATP酶活性，并呈剂量依赖性。50%抑制Na+,K+-ATP酶活性的量为16.0μg/mL[9]，车前草水提醇沉液以0.5g生药/Kg给犬静注，显著引起尿量增多，并使输尿管蠕动频率增加，输尿管上端腔内压力升高，压力变化为蠕动性，短时紧张性压力和长时紧张性压力升高，几方面协同，利于输尿管结石的下移。车前子提取液0.6g生药/只给大鼠灌胃，连续13天，结果显示，车前子有一定降低尿草酸浓度及尿石形成的危险性作用，肾钙含量显著性下降，说明其有较强的抑制肾脏草酸钙结晶沉积的作用。可能是车前利尿排石通淋作用机制之一[10]。

　　近年来研究较多。通过实验表明,车前草及车前子煎剂均显示较强的镇咳与去痰作用。研究发现,车前草中的黄酮类成分β-谷甾醇、车前苷、高车前苷都有镇咳的作用［11］。尤其是车前苷作为车前草的主要有效成分，在治疗中有着重要的作用。

　　车前子对实验性晶状体氧化损伤所致晶体上皮细胞(LEC)凋亡及其凋亡小体形成的影响显示:车前子可明显抑制LEC凋亡,其显著抑制LEC凋亡的作用可能是其防止和延缓白内障发生与发展的细胞学机制，为车前子明目作用作出解释[14]。

　　车前草苷在低剂量时引起心跳减慢和振幅增大，高剂量时引起心脏麻痹和血压过低［15,16］。同时毛平车前还具有显著的降血糖调血脂作用，作用机制可能与提高机体抗氧化能力、减轻自由基对胰岛细胞的损伤有关。毛平车前醇提取物对正常小鼠血糖无明显影响，可明显降低糖尿病小鼠的糖耐量，显著降低糖尿病小鼠血糖及血清中、

　　糖化血清蛋白（GSP），TC，TG，LDL-C，MDA含量，明显升高HDL-C/TC比值、SOD活性和NO含量，并减轻四氧嘧啶对胰岛细胞的损伤[17]。

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